蛋白样品制备中各类杂质和杂蛋白的去除

蛋白样品制备中各类杂质和杂蛋白的去除

蛋白样品制备中，在细胞破碎之后，既可以利用特定蛋白质的特性来分离某一类蛋白质，比如亲和纯化，比如前面介绍的磷酸化蛋白富集，或者膜蛋白富集；另外一个考虑方向是去除杂质----去掉样品中某些非目标高丰度蛋白或者杂质的干扰，同样可以达到简化样本的目的。当然要小心“倒洗脚水的时候别把婴儿也倒掉了”，一定要选择可靠的产品。

比如，潜在疾病标志物的样本来源就是血清或其他体液，此类样本可以提供人蛋白质组中绝大部分组份。然而用蛋白质组分析方法鉴定疾病标志物zui大的挑战来自于血清中大量的高丰度蛋白对检测的干扰，血清中有大约55%的蛋白为白蛋白，而IgG大约占血清中蛋白总量的10-25%，这些高丰度蛋白的存在会增加低丰度蛋白检测的难度，去除占血清总蛋白近75%的白蛋白和IgG将有助于更好地鉴定其他的蛋白。G-Biosciences的AlbuminOUT™白蛋白去除试剂盒堪称白蛋白去除神器。血浆和脑脊髓液等样本中，包含大量的白蛋白，从而封闭掉在二维凝胶电泳中发现和鉴定其他低丰度蛋白的可能。AlbuminOUT™白蛋白去除试剂盒被设计用来在这种样本中大量去除白蛋白。

这种白蛋白去除方法是基于白蛋白和Cibachron蓝色染料的结合。AlbuminOUT™被优化从样本中去除人的白蛋白。AlbuminOUT™使用快速离心柱方法，每个柱子含有0.2ml的染料结合树脂，从而可以结合大于2mg的人白蛋白。AlbuminOUT™可以从5-50微升人血浆中去除大于98%的白蛋白。

离心柱形式可以在10分钟内去除白蛋白。高结合力的蓝色染料结合树脂可以从人，猪，羊，狗，兔，大鼠和牛样本中达到瞬间的结合和去除白蛋白。AlbuminOUT™或许也可以从其他物种中去除白蛋白。适用于处理25或50个样本。

Figure 1:  2D  analysis  of  whole  human  serum  before  (left)  and  after

(right) treatment with AlbminOUT^™.

产品特点：

• 从样本中不到10分钟的时间内去除白蛋白
• 基于白蛋白和Cibachron蓝色染料的结合
• 每个柱子的结合力大于2mg的人白蛋白
• 从5-50微升人血浆中去除大于98%的白蛋白

去垢剂如SDS、Tween、Tritonde等是蛋白样品处理过程中常用的组分。去污剂在蛋白提取和样本制备过程中是很重要的物质，特别是研究疏水蛋白时。蛋白样本中高浓度去污剂的存在能够影响ELISA,IEF和蛋白的蛋白酶消化，以及用质谱进行分析时抑制肽的离子化。

所谓请神容易送神难。要除掉这些去垢剂？G-Biosciences推出的DetergentOUT™ GB-S10去污剂去除柱子和树脂专门设计用来除于蛋白或其他生物样本中所含有的去污剂，树脂能够从蛋白水溶液和肽样本中去除自由的，未结合的阴离子的，非离子或两性离子的去污剂(e.g. SDS, Triton® X-100 或CHAPS)，同时对于下游进行的质谱或其他技术的分析应用带来zui小的样本丢失。

DetergentOUT™ GB-S10柱子在第三方的研究使用中表明*兼容DI-QTOF和 LC-MS/MS（请见参考文献）。DetergentOUT™ GB-S10柱子的使用显著增加到了检测到的肽光谱的数量。除此之外，DetergentOUT™ GB-S10柱子对于去污剂有高度的结合容量，比如每毫升固定的树脂可以结合6mg SDS和14mg Triton® X-100。

Table 1:  A comparison of the detergent removal rates and percentage protein recovery with DetergentOUT^™ GBS10.

Tag蛋白的纯化

带有融合标签的表达产物----融合蛋白的纯化通常也是紧接细胞破碎工作进行的。设计融合标签的主要目的之一就是为了方便后继的亲和纯化。目前zui为流行的融合标签自然是His-Tag，和GST，来自G-Biosciences等公司都有质量非常稳定可靠的产品，种类还特别丰富，分别对应不同的上样量和工作压力和流速的需要。笔者在这里介绍一下江湖中盛传的Tag蛋白纯化的“刀剑笑”，目的就是为在产品选择上帮你省点事......

“横刀”-蛋白亲和纯化GST树脂

G-Biosciences的谷胱甘肽树脂，用于分离GST重组蛋白

用来亲和纯化带有GST标签的蛋白。树脂由还原性的谷胱甘肽通过10个碳原子的间隔臂共价偶联到4%交联的琼脂糖上组成。每毫升树脂可以结合大约8mg GST标签蛋白。树脂浸在20%的乙醇中。谷胱甘肽树脂有单独的树脂也有试剂盒形式提供。除了用于洗脱的还原性谷胱甘肽之外，结合/冲洗和洗脱缓冲液也有提供。

产品特点：

• 用于纯化GST蛋白
• 高载量，8mg/ml
• 配基密度，7-15μmoles 谷胱甘肽/ml
• 树脂尺寸，50-160μm
• 树脂结构，4%交联的琼脂糖
• 10个碳原子的间隔臂

“名剑”-蛋白亲和纯化镍螯合树脂

用于分离6XHis标签重组蛋白，高度结合效率和低的非特异性结合。

固定的金属亲和层析树脂（IMAC）使用镍离子来纯化6XHis标签蛋白。树脂可以结合6X组氨酸残基（6XHis），一种在蛋白纯化中非常常用的标签。树脂由氨基二乙酸偶联到6%交联的琼脂糖上组成。氨基二乙酸可以共价结合到镍离子上，每毫升树脂可以结合20-40μmoles镍离子。

这种镍螯合树脂有单独的树脂也有离心柱形式供选择。

特定的结合和洗脱缓冲液液可以提供，

100ml His结合/冲洗缓冲液

(10mM Imidazole, 0.3M NaCl, 0.05M sodium phosphate (pH8.0))

100ml His洗脱缓冲液

(0.25M Imidazole, 0.3M NaCl, 0.05M sodium phosphate (pH8.0))

产品特点：

• 用于纯化6XHis标签蛋白
• 高载量，大于50mg/ml
• 配基密度，每毫升树脂结合20-40μmoles镍离子
• 树脂结构，6%交联的琼脂糖

“笑三少”-钙调蛋白树脂

钙调蛋白树脂用于亲和纯化钙调蛋白结合蛋白（CBP），包括带有CBP标签的重组蛋白和真核生物中钙调蛋白调控的蛋白。树脂是4%的琼脂糖偶联到钙调蛋白上，配基的密度是1ml树脂大约是1mg钙调蛋白。

钙调蛋白树脂有单独的树脂产品形式以及试剂盒形式，试剂盒包括：

5ml树脂，

100ml钙调蛋白结合/漂洗缓冲液，

(50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl, 2mM CaCl2)

100ml钙调蛋白洗脱缓冲液，

(50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl, 2mM EGTA)

5个1ml离心空柱

5个空的小于5ml的重力流柱

缓冲液同时也可以单独提供。

产品特点：

• 用于纯化钙调蛋白结合蛋白
• 结合CBP标签的重组蛋白
• 高载量，~1-3mg/ml
• 树脂尺寸，50-160μm
• 树脂结构，4%高度交联的琼脂糖
• 配基密度，0.9-1.2mg 钙调蛋白/ml 树脂