蛋白质组学技术篇之蛋白样品制备

蛋白质组学技术篇之蛋白样品制备

开篇之际，首先来看看这两句话：
“在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面的实验中弥补回来的”，
“让我们把蛋白质看作是具有*而奇妙性质的实体”。

蛋白样品制备是许多实验重要的*步，蛋白样品由于其结构特性各异，又必须使其*溶解和尽可能少的化学修饰，所以不可能有一个通用的技术，只能通过大量的实验来积累经验。正如开篇所引用的两句话中包含的深意：在研究蛋白的过程中，既需要严谨的技术流程，规范的操作手段来确保蛋白研究的完整性，也需要将其看成是*而奇妙的个体，结合以往经验但又不拘泥于经验，才能真正揭开她神秘的面纱。2012年让我们一起来回顾一下这一重要技术及值得关注的产品。

为什么要进行样品制备

“为什么要进行样品制备？电泳的目的不就是分离吗？”刚接触双向电泳的小菜鸟有可能就会这么问。这个问题很好回答，这是由于目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上，因此样品的预分离制备是必须的。另外比如像对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记的蛋白质组学研究目的，由于临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型，因此需要进行有效的样品制备。

但是为什么要进行不同步骤的样品制备呢？这不仅仅是由于蛋白本身不同，所以需要不同方法来配合，而且在制备样品的时候，首先需要明确的是什么是实验的zui终目的：是分离尽可能多的蛋白还是分离样品中某些感兴趣的蛋白，这些直接决定了你的制备方法，也决定了实验的成功与否。由于想要分离的蛋白必须是*溶解的，溶解的效果取决于裂解、破碎、沉淀、溶解的过程以及去污剂的选择和各种溶液的组成，因此如果是只对样品中的一部分蛋白感兴趣，可采取预分离的方法，如欲分析的蛋白来自细胞器（细胞核、线粒体和原生质膜），则应先采取超速离心或其他方法将细胞器分离出来再溶解蛋白；如果是希望分离出尽可能多的蛋白，比如进行全蛋白质组分析，则可以将细胞或组织中的蛋白分成几部分，分级制备。

G Biosciences 小贴士：制备的原则：

1. 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
2. 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
3. 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。
4. *去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
5. 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。

以上这五项原则是科学家们的经验智慧总结，基本上可以说是囊括了样品制备过程中的抽象注意事项，之后还会提到具体的注意事项。

样品制备流程

蛋白样品制备过程简而言之就是三步：破碎、沉淀蛋白和去除杂质。虽然说出来不过寥寥的十个字，但是这几个过程经过这么多年，恐怕还没有那位研究人员可以说自己已经*掌握，面对任何蛋白制备手到擒来。

破碎——zui小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原则

样品制备的*步当然是细胞或者其它样品的破碎，这一步看似简单，但是操作中一旦方法不当，就有可能会丢失样品中的蛋白和导致蛋白被修饰。要想毫发无损的通过这一关，首先就要分析样品的来源，是易碎的细胞还是坚硬的组织？是植物细胞还是真菌？要做到有的放矢，才能事半功倍。

破碎的方法有许多种，包括循环冻融法、渗透法、去污剂法、酶裂解法、超声波法、高压法、液氮研磨法、机械匀浆法和玻璃珠破碎法等（可以归纳为机械法、化学法和物理法），这些方法有不同的应用范围，基本的原则都是要以zui小的限度减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解变性，这也就是在样品制备破碎这一步的关键所在。抑制蛋白酶降解，减少操作过程温度或者其他物理化学条件对蛋白质变性的影响，减少核酸污染对后继电泳等分析的污染，都是破碎过程需要考虑的问题。

为了达到更好的后续抽提效果，G Biosciences发明了一种用于样本研磨的小工具，或许可以给你带来事半功倍的效果。EZ-Grind是一种分装到1.5ml的研磨管中的的研磨树脂，同时配套有研磨棒。树脂用于zui适的研磨生物样本从而来提取蛋白和DNA，同时树脂是中性摩擦材质不会结合蛋白或核酸。树脂，研磨棒，研磨管的配套组合可以破坏组织，细胞，细胞核和其他细胞器。它以做到10分钟内一个管里可以处理100mg样本，这个小产品价格不高，但是非常实用，真正想科学家之所想，建议你不妨一试，或许还有惊喜。

蛋白样本制备的目标简言之“三高”，保留活性高，回收产量高，工作效率高。“三高”是苦中作乐的说法，说的轻松，这头一条“保留活性高”便是蛋白样品制备的痛中之痛----样品制备过程导致的蛋白变性和随后的复性工作是很令人头痛的问题。这些年来以G Biosciences为代表的以蛋白质研究为核心研发的公司开发了一系列蛋白抽提试剂，大大简化了样品制备工作的烦恼，更重要的是保证实验结果的可重复性。

八仙过海，各显神通-Focus系列抽提试剂盒，让你的抽提不再是事儿！

针对各种常见样本的抽提，G Biosciences旗下的Focus系列抽提试剂盒可谓是八仙过海，为你带来了是蛋白质样本抽提综合解决方案。如果你的目的是研究蛋白质特性，把时间都耗在纯化过程中那太费时间，看准目标，蛋白纯化也可以连同初步纯化一步到位。这类试剂盒通常在裂解细胞的同时利用某些共性初步分离蛋白质，令产品分段收集，使得在后继的电泳分析中减少背景蛋白的复杂程度，提高蛋白电泳分辨率。下面让我们对这些“神通”一一进行解析。

各显神通之*式-哺乳动物蛋白质组抽提

FOCUS™ 哺乳动物蛋白质组抽提试剂盒-从哺乳动物样本中抽提和溶解几乎所有的蛋白，包括膜蛋白和可溶性蛋白，通过一个强烈的离液剂抽提缓冲液来溶解甚至zui难溶解的蛋白。适用于哺乳动物组织和贴壁&悬浮细胞等生物样本。它可以一步提取实验步骤，同时提供有一个强烈的离液剂抽提缓冲液，用于50X100mg动物组织或50微升湿细胞团样本制备应用，从哺乳动物组织和细胞中提取总蛋白，适用于样本制备用于2D凝胶电泳和其他应用。

各显神通之第二式-蛋白质组分级分离

FOCUS™蛋白质组分级分离试剂盒-用来将复杂的生物样本分级分离为胞质蛋白和膜蛋白。zui终得到的膜蛋白随后分级分离成周边蛋白和膜内嵌蛋白或脂筏相关的蛋白和去污剂溶解的膜蛋白。该试剂盒可以进行大于50次的实验，它的“法力”包括：用于分级分离内嵌蛋白，周边蛋白以及脂筏相关蛋白的组分，分级分离复杂的蛋白质组到多个组分，从组织，细胞，植物，酵母，细菌，昆虫和其他样本来源中分级分离得到膜蛋白，从脂筏中分级分离得到膜蛋白，用于下游的应用，包括1D和2D电泳，免疫印迹和质谱，适用于蛋白质组和细胞信号研究。

各显神通之第三式-酵母蛋白质组抽提

FOCUS™ 酵母蛋白质组抽提试剂盒-特定性设计用于酵母研究同时提供酵母特定性的研究试剂。从酵母中抽提和溶解几乎所有的蛋白，包括膜蛋白和可溶性蛋白。抽提是基于温和的酵母细胞的裂解用一种酵母溶解酶。LongLife™ Zymolyase，这种酶提高了稳定性和效期。酶反应之后是用一起提供的强烈的离液剂抽提缓冲液进行总蛋白质组的抽提，这种抽提缓冲液能够溶解甚至是zui难溶解的蛋白。它的“法力”包括：提供有酵母特异性的溶解酶和强烈的配方的离液剂抽提缓冲液；适用于50X60微升的酵母细胞块的制备，从酵母细胞中提取总蛋白，适用于2D凝胶电泳和其他应用的样本制备。

各显神通之第四式-膜蛋白抽提

FOCUS™膜蛋白抽提试剂盒-一种快速和高度重复性的方法用于从生物样本中制备膜蛋白或疏水蛋白用于二维电泳或其他应用。膜蛋白用相分配法一步法得到抽提，抽提效率大于90%同时带有zui小的亲水蛋白污染。试剂盒提供有必要的试剂用于抽提膜蛋白以及之后的制备过程用于等电聚焦或二维电泳从而得到提高的点分辨率。它的“法力”包括：基于相分离法的膜蛋白的抽提；从组织，细胞，植物，酵母，细菌，昆虫和其他样本中选择性的分级分离膜蛋白；适用于膜蛋白的制备用于一系列下游的应用，包括1D和2D电泳，免疫印迹和质谱

各显神通之第五式-线粒体抽提

FOCUS线粒体抽提试剂盒-从培养的哺乳动物细胞中抽提完整的线粒体。这个试剂盒可以快速的从培养的哺乳动物细胞胞质组分中抽提和富集线粒体。大于90%的线粒体保持完整的内膜和外膜，从而保持功能和活性。试剂盒适用于动物组织和其他来源的线粒体抽提，可以做50次实验，一次实验大约是2X10⁷哺乳动物细胞或者100mg的哺乳动物组织。它的“法力”包括：快速的分级分离线粒体活性的重组分和轻组分；适用于培养的动物细胞和组织；从动物细胞和组织中抽提和富集线粒体的组分；适用于下游一系列应用，包括1D和2D电泳，免疫印迹和质谱。

各显神通之第六式-亚细胞组分抽提

FOCUS亚细胞组分抽提试剂盒-从动物细胞核组织中快速和容易的分离细胞核，线粒体，膜和胞质组分。适用于培养的动物细胞和动物组织。它的“法力”包括：分级分离适用于一系列下游的应用包括1D&2D电泳和免疫印迹；分离得到的线粒体大于90%是有活性的；适用于线粒体，细胞核，胞质和膜组分的分级分离。

各显神通之第七式-信号蛋白分离富集

FOCUS信号蛋白分离富集试剂盒-从其他细胞蛋白中分级分离脂筏定位蛋白，通过采用非离子去污剂的方法。信号蛋白抽提缓冲液是的非离子去污剂配方，可以的抽提和去除可溶性蛋白，剩下包含信号蛋白的脂筏作为不溶于去污剂的组分。zui后脂筏溶解于FOCUS蛋白溶解缓冲液中，和1种2D电泳兼容缓冲液或一种其他选择的缓冲液。该试剂盒可以用来做50次实验，它的“法力”包括：分级分离脂筏定位蛋白；提供一个2D电泳兼容缓冲液；分离定位于脂筏上的信号蛋白；研究活化的蛋白在离开和到达脂筏的移动；适用于2D凝胶电泳，蛋白质组和细胞信号研究。

各显神通之第八式-磷酸化蛋白富集

细胞内信号通路失调往往是引起癌变或者肿瘤发生的成因，其特征之一是信号通路成员蛋白质的可逆磷酸化。因此研究细胞信号通路各关键分子的磷酸化水平是分析细胞内信号传导的研究重点之一。要从芸芸众生中专门发掘磷酸化蛋白，你可能需要FOCUS Phosphorich磷酸化蛋白富集试剂盒。

FOCUS Phosphorich磷酸化蛋白富集试剂盒-一种即开即用的试剂盒，能够从复杂的生物学样本中富集磷酸化的蛋白和磷酸化的肽。试剂盒中含有微量离心柱，柱内的树脂可以结合磷酸化的蛋白，结合量是每个柱子结合磷酸化的卵白蛋白大约20mg。通过再生和适当储存，柱子可以重复利用。它的“法力”包括：使用磷酸化蛋白结合离心柱；磷酸化蛋白的迅速结合和洗脱；富集磷酸化的蛋白和肽；适合于下游一系列应用，包括1D和2D电泳，免疫印迹和质谱；适合于蛋白质组和细胞信号研究。

目前蛋白组学研究在世界尤其以中国为首的亚洲国家正如火如荼，更好的进行样本的抽提可以为下游的工作打好坚实的基础，FOCUS系列非常符合“三高”的理念要求，在世界*研究机构已经使用的非常普遍，笔者建议你一试便知。